2020-10-23, 04:00 PM
Bonjour à tous,
je suis hyper-ravi que ce groupe 3C existe car avec l'évolution rapide des projets au sein de ma plateforme, je me dois de prendre de l'avance dans les nouvelles méthodes d'analyse !
J'ai une question assez concrète sur quelle serait la (les) stratégies à adopter pour enregistrer de la manière la plus rigoureuse possible les données de cytométrie en vue de pouvoir effectuer une normalisation valable des intensités de fluorescence, d'une expérience à l'autre, lors d'une analyse multi-dimensionnelle ?
Le projet concerne l'analyse de populations immunitaires et non-immunitaires (fibroblastes/cellules endothéliales) à partir de biopsies synoviales de patients atteints de polyarthrite-rhumatoïde. Il y aura un suivi longitudinal des patients pendant environ 2 ans. J'ai un panel 15 couleurs pour identifier les populations d'intérêts et les cloner (FACS ARIA III) en plaques 384 puits pour du single-cell RNAseq. C'est un projet conséquent qui va demander une grande rigueur à toutes les étapes afin que l'analyse bio-info puisse donner des résultats interprétables !
Je vois le plugin Cytonorm que FlowJo propose qui est probablement intéressant et je suis sûr qu'il existe également d'autres possibilités mais ma question concerne plus la stratégie à adopter au niveau de l'enregistrement des données FACS afin de pouvoir effectuer une vraie normalisation qui ne va pas masquer la diversité biologique qui serait réelle.
Faut-il absolument utiliser les "applications settings" ? Que se passe-t-il quand un lot d'anticorps (que nous suivons) change ? Dans le cas d'un tandem, l'efficacité de FRET pouvant être différente, cela devient un "nouveau" fluorochrome à chaque n° de lot. L'application setting ne serait alors plus valable d'où la question de son utilité réelle ?
Nous faisons de manière systématique les compensations pour chaque expérience et nous avons des cellules (aliquot de PBMCs congelés) que nous utilisons à chaque fois et qui nous servent de contrôle qualité du marquage.
Est-ce qu'il faut ajouter par exemple l'acquisition de rainbow beads pour aider à la normalisation des données lors de l'analyse bio-info ?
merci d'avance pour vos réponses !
Nicolas
Nicolas Dauguet, PhD
flow cytometry & cell sorting facility (CYTF)
de Duve Institute, GECE unit
Avenue Hippocrate 74, 1200 Bruxelles
email: nicolas.dauguet@uclouvain.be
Ph: +32(0)2.764.75.79 (office)
Ph: +32(0)2.764.75.89 (cell-sorting room)
Ph: +32(0)2.764.75.48 (FlowJo analysis workstation room)
web : http://www.deduveinstitute.be/flow-cytom...ll-sorting
je suis hyper-ravi que ce groupe 3C existe car avec l'évolution rapide des projets au sein de ma plateforme, je me dois de prendre de l'avance dans les nouvelles méthodes d'analyse !
J'ai une question assez concrète sur quelle serait la (les) stratégies à adopter pour enregistrer de la manière la plus rigoureuse possible les données de cytométrie en vue de pouvoir effectuer une normalisation valable des intensités de fluorescence, d'une expérience à l'autre, lors d'une analyse multi-dimensionnelle ?
Le projet concerne l'analyse de populations immunitaires et non-immunitaires (fibroblastes/cellules endothéliales) à partir de biopsies synoviales de patients atteints de polyarthrite-rhumatoïde. Il y aura un suivi longitudinal des patients pendant environ 2 ans. J'ai un panel 15 couleurs pour identifier les populations d'intérêts et les cloner (FACS ARIA III) en plaques 384 puits pour du single-cell RNAseq. C'est un projet conséquent qui va demander une grande rigueur à toutes les étapes afin que l'analyse bio-info puisse donner des résultats interprétables !
Je vois le plugin Cytonorm que FlowJo propose qui est probablement intéressant et je suis sûr qu'il existe également d'autres possibilités mais ma question concerne plus la stratégie à adopter au niveau de l'enregistrement des données FACS afin de pouvoir effectuer une vraie normalisation qui ne va pas masquer la diversité biologique qui serait réelle.
Faut-il absolument utiliser les "applications settings" ? Que se passe-t-il quand un lot d'anticorps (que nous suivons) change ? Dans le cas d'un tandem, l'efficacité de FRET pouvant être différente, cela devient un "nouveau" fluorochrome à chaque n° de lot. L'application setting ne serait alors plus valable d'où la question de son utilité réelle ?
Nous faisons de manière systématique les compensations pour chaque expérience et nous avons des cellules (aliquot de PBMCs congelés) que nous utilisons à chaque fois et qui nous servent de contrôle qualité du marquage.
Est-ce qu'il faut ajouter par exemple l'acquisition de rainbow beads pour aider à la normalisation des données lors de l'analyse bio-info ?
merci d'avance pour vos réponses !
Nicolas
Nicolas Dauguet, PhD
flow cytometry & cell sorting facility (CYTF)
de Duve Institute, GECE unit
Avenue Hippocrate 74, 1200 Bruxelles
email: nicolas.dauguet@uclouvain.be
Ph: +32(0)2.764.75.79 (office)
Ph: +32(0)2.764.75.89 (cell-sorting room)
Ph: +32(0)2.764.75.48 (FlowJo analysis workstation room)
web : http://www.deduveinstitute.be/flow-cytom...ll-sorting